人殺菌性/通透性增加蛋白（BPI）ELISA檢測的操作步驟如下： 洗滌步驟
加入洗滌緩沖液（1× PBS或廠家指定緩沖液）至各孔，靜置30秒后棄去液體，重復3次。次洗滌后，將微孔板倒扣于吸水紙上輕拍，確保孔內無殘留液體。注意避免交叉污染，建議使用多道移液器或自動洗板機以提高效率。 酶標抗體孵育 按說明書稀釋標記的檢測抗體，每孔加入100 μL，覆蓋板底。封板膜密封后，37℃孵育60分鐘。若室溫（25℃）操作，需延長孵育時間至90分鐘以確保充分結合。 二次洗滌 重復步驟6的洗滌流程，進一步去除未結合的檢測抗體。此步驟對降低背景信號至關重要，建議增加至5次洗滌（高靈敏度檢測時）。 顯色反應 每孔加入新鮮配制的TMB底物溶液100 μL，避光室溫反應15-20分鐘。若觀察到標準品孔呈現明顯梯度藍色即可終止；若顯色過弱，可延長至30分鐘（需同步延長所有孔反應時間）。 終止與讀數 加入50 μL 2M硫酸終止液，輕震混勻后立即用酶標儀在450 nm波長下檢測吸光度（OD值）。若儀器支持雙波長校正，建議設定630 nm為參比波長以減少孔間誤差。 注意事項 - 樣本處理：血清/血漿需離心去除纖維蛋白，避免溶血；細胞培養上清需0.22 μm濾膜過濾。 - 標準曲線擬合：建議采用四參數邏輯（4PL）回歸模型，確保低濃度區準確性。 - 質量控制：每板應包含空白孔（僅加緩沖液）、陰性對照（不含BPI的樣本）及復孔，CV值需＜15%。 常見問題分析 - 高背景信號：檢查洗滌是否充分，或抗體濃度是否過高。 - 標準曲線線性差：確認標準品稀釋準確性，避免反復凍融。
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